多能干细胞(PSC)培养体系应在正常情况下准备传代时收获并冷冻保存。每支冻存管应包含6孔板中一个孔收获的细胞。如果使用其他培养皿，请相应地调整体积。

1. 使用团块or单细胞进行冻存？

2. 冻存与复苏PSC团块的建议：

a. 推荐使用CryoStor CS10或mFreSR(仅适用于在mTeSR1#85850 / mTeSR Plus#100-0276 中培养的PSC)进行多能干细胞的团块冻存。

b. 可以通过以下方式获得更大的团块(> 150 µm)，以优化冻存方案:

· 使用2 ml规格的移液管

· 如果使用GCDR(Gentle Cell Dissociation Reagent)进行解离,将孵育时间减少到1-2分钟，并最大限度地减少刮擦

· 如果使用ReLeSR#100-0483 进行解离，将孵育时间缩短至约1-2分钟

c. 复苏时，在接种前轻轻研磨较大的团块，以产生50 µm大小的细胞团块。

d. 如果复苏后仅观察到少量未分化的细胞团块，可能需要仅选择这些团块进行传代，并将它们重新铺在新包被的平板上相同大小的孔中(即不进行分孔传代)。

3. 冻存与复苏PSC单细胞的建议：

a. 推荐使用FreSR™-S#05859 进行多能干细胞的单细胞冻存。

b. 使用ACCUTASE#07920 或GCDR进行解离至单细胞。

c. 使用可控速率冷冻方法，以1x10^6个细胞/冻存管的密度进行冻存。

d. 为了获得最高的细胞复苏率，复苏后将CloneR™2#100-0691 添加到培养基中。

4. 冻存hPSC的注意事项

a. 在开始解离之前即提前冷却冷冻保存的培养基。

b. 在传代时，每支冻存管保存6孔板中一孔的细胞(可根据培养体系的密度变化)。

c. 按照1×10^6个细胞/冻存管的密度进行冻存。

d. 团块传代hPSCs，因为连续的单细胞传代会增加核型异常的风险。如果单细胞传代是首选或下游应用需要的，使用eTeSR™来增强培养物的遗传稳定性。

5. 复苏hPSC的注意事项

a. 在37°C水浴或ThawSTAR®CFT2自动解冻系统中快速解冻细胞，确保样品无菌和解冻性能稳定。打开前用70%乙醇或异丙醇擦拭冻存管的外部。

b. 当只剩下一个小冰球时，用2ml移液管将细胞转移到一个空的锥形管中。向细胞中滴加PSC维持培养基，避免渗透休克，促进恢复。

c. 使用与冻存前相同的培养系统（如mTeSR™1/mTeSR™Plus或TeSR™-E8™等）。

d. 将一支冻存管中的细胞放入提前包被的6孔板的1-2孔中(取决于冷冻保存的团块或单细胞的数量)。

e. 复苏后的第一次传代可能比预期的要早。这些细胞往往非常趋向于融合。经过一次传代调整到适当的接种密度后，形态应该会恢复。

6. ROCK抑制剂（Y-27632)的添加

a. 单细胞冻存时，复苏后加入单细胞培养体系，24h后撤去。

b. 团块冻存时，可以添加到PSC培养基中，复苏后团块培养24小时。我们不推荐这种方法，因为这可能会导致细胞密度超过生长最佳接种密度，或可能导致过度生长和其他问题。Y-27632#72302 有助于hPSC团块的附着，但不是必需的。

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