多能干细胞(PSC)培养体系应在正常情况下准备传代时收获并冷冻保存。每支冻存管应包含6孔板中一个孔收获的细胞。如果使用其他培养皿，请相应地调整体积。

团块冻存

注意：开盖之前，用70%的乙醇或异丙醇擦拭瓶身。

以下说明适用于在mTeSR1#85850 / mTeSR Plus#100-0276 / TeSR™-E8™#05990 中培养的hPSC的冻存，使用CryoStor CS10#07930或mFreSR#05855 皆可。细胞应该在适合传代的时候进行收获和冻存。每支冻存管所含有的细胞应当来源于6孔板的1个培养孔。如果使用其他体积的培养皿，请相应的调整冻存体积。

注意：如果使用mFreSR™，融化所需量的mFreSR™然后放置于冰上。

1. 用无酶法或酶解法进行传代，将解离后的细胞团块刮取下来转移至15ml离心管。

2. 在室温（15-25°C）以300 x g离心5分钟。

3. 轻轻吸走上清液，注意不要扰动细胞沉淀。

4. 用移液枪以1 mL的mFreSR™或CryoStor® CS10重悬细胞。在打散细胞团时，尽量减少细胞团块分解。

5. 用2 mL的移液管将1 mL的细胞团块转移到标记好的冻存管中。

6. 用以下方法冻存细胞团块:

  · 推荐使用缓速降温方法，每分钟降低1度，随后可以在-­135°C液氮或更低的温度长期保存。不推荐在 ­80°C长期保存。

  · 逐步降温法：-20°C保存2个小时，然后-­80°C中保存2个小时，随后可以在-135°C液氮中或更低的温度长期保存。

hPSC应复苏至提前包被好的培养皿中。一般来说，按上述方法冷冻保存的一冻存管细胞可以成功地接种到6孔板的1-2孔中。

1. 在开始操作之前，准备好所有的试管，恢复至室温的mTeSR1 / mTeSR Plus / TeSR™-E8™培养基(15 - 25°C)和包被好的培养皿，以确保解冻过程尽快完成。

注意:不要在37°C的水浴中加热培养基。

2. 用70%乙醇或异丙醇擦拭细胞瓶的外部。

3. 在生物安全柜中，将瓶盖旋转四分之一圈以释放内部压力，然后重新拧紧。

4. 在37°C的水浴中轻轻摇动小瓶，快速解冻细胞。当有小的冷冻细胞颗粒残留时，取出小瓶。不要涡旋振荡细胞。

5. 用70%乙醇或异丙醇擦拭瓶身。

6. 使用2ml移液管(#38002) 将冻存管的内容物转移到15ml锥形管中。

注意:使用2ml的移液管而不是1ml的移液管将最大限度地减少细胞聚集体的破坏。

7. 将5 - 7ml 已恢复室温的培养基滴入15ml管中，随着培养基的加入，轻轻混匀。

8. 在室温(15 - 25°C)下，300 x g离心细胞5分钟。

9. 抽吸培养基，保持细胞团块完整。用2ml移液管将细胞重悬于1ml 培养基中。注意保持细胞的团块。

10. 将0.5 mL细胞混合物转移到含有培养基的已包被6孔板的1孔中(即每支冻存管可接种2孔)。

注:孔的数量可能需要调整，取决于冻存时的团块密度。

11. 将培养皿置于37°C培养箱中。前后左右快速轻柔移动培养皿，使接种的细胞均匀分部在孔中。24小时内不要打扰培养体系。

注:团块的不均匀分布可能导致hPSC分化增加。

12. 根据需要使用培养基进行换液，并每天可视化评估培养体系以监测生长情况，直到下一次传代。检查复苏后约6 - 7天准备传代时(密集中心)的未分化区域。

培养基可以每天或每隔一天更换。若连续两天跳过换液，则应添加两倍量的培养基。

注意:如果在复苏后只观察到少数未分化的细胞，需要只选择这些细胞进行传代，并在新包被的板上接种相同大小的孔(即不分孔传代)。

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