用mTeSR™1培养人ES和iPS细胞

众所周知，mTeSR™1是文献发表最为广泛的hPSC培养基，cGMP级别且无需饲养层，引用文献超过1500篇，被广泛用于各种前沿的hPSC研究中，包括基因编辑和3D悬浮培养等。我们将推出hPSC维持培养专题，详细介绍多能干细胞的维持培养、传代、冻存和解冻等。

本期我们就来谈一谈mTeSR™1培养hPSC的标准流程：

1. 细胞在mTeSR™1培养的形态

未分化的人ES细胞（图1A和图2A）和iPS细胞（图3A和图4A）在mTeSR™1中培养，形成紧密的多细胞集落，具有清晰的边界。细胞间紧密的堆积起来，具有高核质比，且核仁显著。健康的集落会无缝的融合起来，在中心有多层细胞，在相衬显微镜下观察， 成紧密的细胞簇。mTeSR™1中培养的集落在Vitronectin XF™上生长时更紧密且更圆（图1和图3），而使用Corning® Matrigel®生长的集落则较为分散且形状不规则。 在这两种基质上，自发性分化的特征表现为失去集落边界的完整性，一个集落内有不规则的细胞形态区域，或者出现其他的细胞类型等（图1B，图2B，图3B）。

图1. 在 Vitronectin XF™上和mTeSR™1中培养的人ES细胞的形态特征。（A）最佳传代时的未分化的人ES细胞（H1和H9）。（B）两个未分化的H1集落中间出现自发性分化的区域（橙色圈中）。图像使用了三种放大倍率：20X，40X和400X。

图2. 在Corning® Matrigel®和mTeSR™1中培养的人ES的形态特征。（A） 最佳传代时期未分化的人ES细胞（H1和H9）。（B）在一个未分化的H1集落旁边自发性分化的区域（橙色圈中）。图像使用了三种放大倍率： 20X， 40X和400X。

图3. 在Vitronectin XF™和mTeSR™1中培养的人iPS细胞的形态特征。（A） 最佳传代时期未分化的人iPS细胞细胞（WLS-4D1和WLS-1C）。（B） 在两个未分化WLS-1C集落中间出现的自发性分化区域（橙色圈中）。 图像使用了三种放大倍率：20X， 40X和400X。

图4. 在Corning® Matrigel®和mTeSR™1中培养的人iPS细胞的形态特征。（A） 最佳传代时期未分化的人iPS细胞（WLS-4D1和WLS-1C）。（B） 未分化WLS-1C集落边界旁的自发性分化区域（橙色圈中）。图像使用了三种放大倍率：20X，40X和400X。

图5. 传代1 - 7天后的人ES细胞培养于Vitronectin XF™和mTeSR™1中的形态。人ES细胞（H1）的照片，分别放大（A）20倍（B）40倍。对这种培养体系，第7天是最佳的传代时间。注意：最佳的传代时间由铺板密度和聚集体大小决定。

图6. 传代1 - 7天后的人ES细胞培养于Corning® Matrigel®和mTeSR™1中的形态。人ES细胞（H1）的照片，分别放大（A）20倍（B）40倍的照片。对这种培养体系，第7天是最佳的传代时间。注意：最佳的传代时间由铺板密度和聚集体大小决定。

图7. 传代1 - 7天后的人iPS细胞培养于Vitronectin XF™和mTeSR™1中的的形态。人iPS（WLS-4D1）细胞的照片，分别放大（A）20倍（B）40倍。对这种培养体系，最佳的传代时间是第七天。注意：最佳的传代时间由铺板密度和聚集体大小决定。

图8. 传代1 - 7天后人iPS细胞培养于Corning® Matrigel®和mTeSR™1中的形态。人iPS细胞（STiPSM001）的照片，分别放大（A）20倍（B）40倍。对这种培养体系，最佳的传代时间是第七天。注意：最佳的传代时间由铺板密度和聚集体大小决定。

2. 使用mTeSR™1进行培养时如何确定传代时间

在mTeSR™1中培养的人ES和iPS细胞，当大多数集落长得大，紧密，集落的中心比边缘更致密的时候，就可以传代了（图5，图6，图7，图8）。使用其他培养基时集落形态会有所不同。在mTeSR™1中铺板第4天，集落可能还没有显示非常致密的细胞堆积，但四天后，集落的密度和大小会迅速增加，同时在传代之前的1-2天，集落的形态也会发生显著的变化。

如果将集落传代的太早或者太频繁，在铺板的时候，细胞聚集体也许会变得不贴壁，导致产率降低，而且细胞也可能会开始分化（出现其他的细胞种类和不同的形态）。如果传代时间太晚，培养物可能会开始出现分化的迹象。大概会有24 - 48小时的最佳传代时间窗口。如果出现较大的集落，并具有有致密的中心，需要在24小时内传代。

3. 试剂和材料的准备

3.1 配制mTeSR™1完全培养基

使用无菌操作制备mTeSR™1的完全培养基（基础培养基 + 5X 添加物）。下面的示例是配置500 mL的完全培养基。如需准备其他体积，请按照比例调整。
注意：在室温（15 - 25°C）融解添加物和完全培养基，或者2 - 8°C过夜融解。不可使用37°C 水浴解冻。

（1） 将mTeSR™1 5X 解冻添加剂并完全混匀。
注意：一旦解冻，立即使用或者分装并储存于 -20°C，于 -20°C可存贮3个月。不要超过添加剂的有效期。分装的添加剂融解后，立即使用。不可再次冷冻。

（2） 将100 mL 的mTeSR™1 5X添加剂加入到400 mL的mTeSR™1基础培养基中，彻底混匀。
注意：如果不立即使用，mTeSR™1完全培养基可以在2 - 8°C存储2周。或者分装并储存于 -20°C可达6个月。不可超过每个单独组分的有效期。分装的完全培养基融解后，立即使用或者在2-8°C保存可达2周。不要重新冷冻。
如果是无菌制备，mTeSR™1完全培养基可以立刻使用。如果需要，也可以用0.2 μm低蛋白滤器过滤。

3.2 培养器皿的基质包被

使用mTeSR™1成功的培养人ES和iPS细胞，需要恰当的基质让细胞聚集体贴附。推荐搭配Vitronectin XF™（产品号 #07180）或者Corning® Matrigel® hESC-Qualified Matrix（Corning 产品号 #354277）和mTeSR™1配合使用。当需要成分完全确定的培养体系时，推荐使用Vitronectin XF™重组蛋白基质。

3.2.1 Vitronectin XF™

用Vitronectin XF™包被培养皿时，需进行无菌操作。
注意：使用非组织培养处理的培养皿（例如非组织处理的6孔板; 产品号 #27147）。

（1） 在室温（15 - 25°C）将Vitronectin XF™解融。

（2） 将Vitronectin XF™用CellAdhere™稀释缓冲液（产品号 #07183）稀释到终浓度10 μg/mL （例如，40 μL的Vitronectin XF™加入到每毫升的CellAdhere™稀释缓冲液中）。用50 mL的聚苯丙乙烯尖底管稀释Vitronectin XF™。

（3） 温和的混匀稀释的Vitronectin XF™，不要涡旋震荡。

（4） 立即使用稀释好的Vitronectin XF™溶液包被非组织处理的培养基。表1是推荐的包被体积。

表1. 包被培养皿的推荐体积

* 包被Vitronectin XF™需要使用非组织处理的培养皿。

（5）轻柔的前后摇晃培养皿，让Vitronectin XF™溶液均匀的覆盖培养皿表面。
注意：如果培养皿的表面没有被Vitronectin XF™完全覆盖，不可用于人ES或iPS细胞的培养。

（6） 使用前在室温（15 - 25°C）孵育至少1个小时。不要让Vitronectin XF™ 挥发。
注意：如果不是立即使用，培养皿必须密封防止Vitronectin XF™溶液的蒸发（比如使用Parafilm®密封），在2 - 8°C 可以存放一周。使用前，经冷藏的包被培养皿需要在室温（15 - 25°C）下放置30分钟以恢复到室温。

（7） 轻轻的将培养皿向一侧倾斜，让多余的Vitronectin XF™溶液集中在一侧。用吸管或者泵吸取多余的溶液。
注意：不要刮花包被的表面。

（8） 用CellAdhere™稀释液清洗一次培养皿（例如，如果用6孔板，用2 mL/孔清洗）。

（9） 吸走清洗液，加入mTeSR™1 培养基（例如，6孔板，每孔加入2 mL）。